В 1955 году газеты написали, что в Калифорнии создали жизнь в пробирке. Биохимик Хайнц Френкель-Конрат потом подчеркивал, что за такие заявления прессы он не отвечает. Вместе с Робли Уильямсом он разобрал вирус табачной мозаики на белок и нуклеиновую кислоту, а потом смешал их снова. Части сами собрались в палочки длиной 300 нм, такие же, как у настоящего вируса, и снова заразили табак.
К тому времени табак больше шестидесяти лет служил главным растением вирусологов. Агрономы изучали болезни табака, потому что табак приносил деньги, а возбудитель мозаики оказался еще и на редкость удобным для опытов. Он прочный, в больном листе его много, и он легко передается. Каждое из этих свойств ученые со временем превратили в инструмент.
Мозаика - одна из самых упорных болезней табака
Больной лист покрывается пестрыми пятнами, темно-зелеными и светлыми, чаще всего вдоль жилок, и участки с пятнами отстают в росте. Американское фитопатологическое общество упоминает и свинцово-серый оттенок, и горький вкус больного листа. В начале XX века табаководы в США теряли из-за мозаики от 20 до 80% урожая.
Энциклопедия Брокгауза и Ефрона отмечала, что заражаются только совсем молодые листья, а лист длиной уже в несколько сантиметров болезни не поддается. Сильнее всего болезнь развивается во влажной почве, при влажном воздухе и в жару. Но хуже всего для табаковода прочность возбудителя. Вирус годами сохраняется в высушенном листе, даже в сигарах и сигаретах из зараженного табака, и переходит на здоровые растения от простого прикосновения.
Майер нашел заразный сок, но решил, что дело в бактерии
Адольф Майер, директор сельскохозяйственной опытной станции в голландском Вагенингене, взялся за болезнь в 1879 году, а результаты опубликовал только через семь лет. Сначала он перебрал очевидные причины - почву, удобрения, свет, температуру, червей-нематод, паразитические грибы. Ни одна не подошла. «Тогда я вдруг обнаружил, что сок больных растений, полученный растиранием, - верное заразное начало для здоровых», - писал Майер.
Дальше он сделал два наблюдения, которые подвели его вплотную к открытию. Сок, нагретый до 80 °C, больше не заражал. А после многократного фильтрования через бумагу получался прозрачный фильтрат, который тоже терял заразность. Майер решил, что фильтр задерживает бактерию, и на этом остановился.
Ивановский и вирус, которого он не признал
Доклад Дмитрия Ивановского 1892 года обычно пересказывают как открытие вируса. Сам Ивановский понимал свой результат иначе. Когда заразный сок прошел сквозь фарфоровый фильтр, рассчитанный на задержку бактерий, Ивановский первым делом заподозрил брак и проверил фильтры. Они оказались исправны. Тогда он предложил объяснение в духе своего времени - в фильтрате есть либо мельчайшие бактерии, проскочившие сквозь поры, либо токсин, который бактерии выделили. Вторую версию он считал самой простой «по господствующим ныне взглядам».
Докторскую диссертацию «Мозаичная болезнь табака» Ивановский защитил в 1903 году и описал в ней включения в клетках больных листьев, которых нет у здоровых. Позже их назвали кристаллами Ивановского. Но и тогда он держался бактериальной версии и много раз пытался вырастить возбудителя на питательных средах. Ни одна попытка не удалась.
Бейеринк и два миллиметра агара
Мартинус Бейеринк из Делфта работу Ивановского, по-видимому, не знал. Главным в его статье 1898 года стал опыт с агаром - плотным желе, на котором микробиологи выращивают бактерии. Бейеринк нанес заразный сок на пластину агара, и за десять дней заразное начало ушло вглубь примерно на 2 мм. Бактерии так не умеют, они остаются на поверхности. Значит, возбудитель растворен в соке, как сахар в воде.
Бейеринк выяснил о нем и другое:
- он заражает только молодые, делящиеся клетки растения;
- движется по растению с соком по проводящей ткани, флоэме;
- переживает высушивание больной ткани и три месяца хранения сока;
- погибает при нагревании до 90 °C.
Отсюда Бейеринк сделал вывод, на который не решился Ивановский, - возбудитель не микроб, а нечто принципиально новое. О том, кому отдать первенство, историки спорят до сих пор. Американский биохимик Уэнделл Стэнли в 1944 году называл первооткрывателем Ивановского, а голландский вирусолог Люте Бос в 1995 году отдал первенство Бейеринку - именно потому, что тот понял значение своей находки.
Бейеринк заметил, что соком одного больного растения можно заразить «бесконечное множество здоровых». Яд от растения к растению разбавлялся бы и слабел, а этот возбудитель размножался в живой ткани.
Как вирус научились считать по пятнам
Следующая трудность была практическая - как измерить, сколько вируса в образце. У Nicotiana glutinosa, дикого родственника табака из Перу, вирус не расходится по всему растению. На месте каждого заражения появляется маленькое пятно отмершей ткани, и вирус остается внутри него. В 1929 году фитопатолог Фрэнсис Холмс превратил эту особенность в способ измерения. Он натирал листья соком и считал пятна - чем больше пятен, тем больше вируса было в соке. Сам прием натирания листа стал для вирусологов стандартным.
Пятна оказались защитой растения - клетки вокруг места заражения погибают и не выпускают вирус дальше. В 1938 году Холмс показал, что такую реакцию передает по наследству один доминантный ген, и назвал его N. Ген N перенесли в культурный табак межвидовым скрещиванием и многократными возвратными скрещиваниями. Он до сих пор остается самым распространенным источником устойчивости к мозаике в селекции табака.
Кристаллы, в которых нашлась нуклеиновая кислота
Стэнли, коллега Холмса по Рокфеллеровскому институту, получил вирус в виде кристаллов в 1935 году, а подробности привел в Нобелевской лекции. Кристаллы были такими мелкими, что разглядеть их удавалось при увеличении примерно в 400 раз. Зато при помешивании раствор отливал атласным блеском. Поражала и заразность. Раствор, в миллилитре которого была всего миллиардная доля грамма вещества, обычно заражал растение.
Стэнли называл вирус белком «или веществом, очень тесно связанным с белком», и оговорка оказалась важной. В декабре 1936 года англичане Фредерик Боуден и Норман Пири сообщили, что в кристаллическом вирусе есть нуклеиновая кислота. Еще через три года немецкие ученые Кауше, Пфанкух и Хельмут Руска впервые получили снимок растительного вируса в электронном микроскопе. На снимке были палочки, по оценке Стэнли размером 15 на 280 нм.
Полая трубка и вирус, который собирается сам
Как белок и нуклеиновая кислота уложены в палочке, выяснила группа Розалинд Франклин в лондонском Биркбек-колледже. Вирусом табачной мозаики Франклин занялась в 1953 году. С Аароном Клугом, Кеннетом Холмсом и Джоном Финчем она показала, что частица полая, а одиночная нить РНК закручена спиралью внутри белковой оболочки. За пять лет группа выпустила 17 статей.
В 1957 году Франклин попросили сделать модели вирусов для Всемирной выставки 1958 года в Брюсселе, и модель вируса табачной мозаики, построенная ее группой, попала в экспозицию. Самой Франклин не стало в апреле 1958 года. Работу ее группы продолжил соавтор Аарон Клуг, и в 1982 году он стал нобелевским лауреатом по химии.
После сборки 1955 года оставался главный вопрос - что в вирусе отвечает за наследственность. Френкель-Конрат и биохимик Беатрис Зингер пытались очистить РНК вируса так, чтобы она перестала заражать, и, по его словам, «к сожалению, или скорее к счастью», не смогли. Голая РНК заражала табак, хотя раз в тысячу слабее целого вируса. Тот же результат в 1956 году получили в Германии Альфред Гирер и Герхард Шрамм.
Решающий опыт поставили в Беркли. Белок одного штамма вируса соединили с РНК другого. Растения болели так, как болеют от штамма, который дал РНК, и белок у нового поколения вирусов тоже был как у этого штамма. Наследственность вируса записана в РНК, а белок служит ей упаковкой. Сегодня известно, что палочка длиной 300 нм собрана примерно из 2130 одинаковых белков и на каждый белок приходится по три звена РНК. Эту точную конструкцию частица собирает сама. Именно ее самосборку и увидели в 1955 году, когда газеты поторопились заговорить о создании жизни.
